LES   TECHNIQUES   DE  CULTURE   IN   VITRO

Nous présentons dans cette page les principales techniques de culture in vitro utilisées au laboratoire TECHNIVIT

! le vocabulaire spécifique est expliqué dans le lexique

LA  MICROPROPAGATION in vitro ou le CLONAGE végétal

  • Définition et technique

Les plantes se reproduisent par la voie sexuée via les graines, mais elles utilisent pour certaines aussi une autre voie, celle de la multiplication végétative. La particularité de cette reproduction est que les plantes filles qui en sont issues sont identiques génétiquement à la plante mère: c'est le clonage végétal ou multiplication conforme qui est exploitée depuis des siècles par les horticulteurs et jardiniers : bouturage, marcottage, greffage etc.

La micropropagation in vitro dérive de ce phénomène naturel. On cultive des explants végétaux stérilement, sur un milieu artificiel et dans un environnement contrôlé. Suite aux subcultures successives on obtient alors des plantes identiques à la plante de départ et que l'on peut multiplier à l'infini. On exploite ainsi la propriété de totipotence des cellules végétales.

  • Objectif

Il s'agit de produire en grande quantité des cultivars d'intérêt horticole, sylvicole, ou agronomique qui viennent d'être créés ou découverts ou qui ont toujours un intérêt.

Il peut s'agir également de plantes difficiles à reproduire naturellement.

  • Avantages

Les plantes obtenues sont génétiquement identiques à la plante ou variété de départ

La puissance de multiplication du clonage in vitro permet une production d'un grand nombre de plantes génétiquement homogènes en un laps de temps court. En 1 an, on peut produire en théorie plus de 4 millions de plants d'œillets à partir d'un seul apex, ou encore 50 000 plants de framboisiers alors que traditionnellement on en obtient 50.

Les plantes obtenues sont de qualité car en très bon état sanitaire, avec un enracinement régulier, des ramifications nombreuses, donc une vigueur accrue.

Le volume de plantes nécessaire à la mise sur le marché des nouvelles variétés est plus rapidement atteint.

La production de plantes in vitro permet de s'affranchir des saisons. Les cultures peuvent être ainsi programmées afin d'utiliser rationnellement les surfaces de serres.

La réduction du nombre de pieds mères nécessaire à la production de boutures permet un gain de place dans les serres d'où une économie d'énergie.

Pour les espèces fruitières ou ornementales, en multipliant in vitro, il est possible de s'affranchir des portes-greffes. Ainsi les arbres ou arbustes obtenus ne présenteront pas de problème de rejet de "sauvageon".

Le micro bouturage permet de multiplier des espèces difficiles à reproduire naturellement telles les orchidées d'où une diminution du coût de production. En faisant germer les graines d'orchidées in vitro , la présence des champignons symbiotiques est inutile.

La culture in vitro permet de multiplier des plantes stériles

Il est possible de conserver des variétés anciennes à l'abri des parasites et pathogènes, dans un espace réduit dû à la miniaturisation des vitroplants: plus de 1 000 plants/m2.

On peut reboiser très rapidement des plantations qui pourraient être ravagées par des parasites ou des catastrophes naturelles.

Les vitroplants sont très facilement transportables d'un pays à l'autre sans risques sanitaires

  • Inconvénients 

Le coût du plant in vitro est plus élevé que celui d'une bouture obtenue classiquement, il demande une main-d'œuvre spécialisée qui représente environ 60% à 70 % du prix de revient car l'automatisation est limitée.

  • Applications

Des centaines de millions de plantes issues de micro bouturage sont produites annuellement dans le monde, dans un nombre toujours grandissant d'espèces. Plus de 300 espèces seraient concernées par la multiplication in vitro à l'échelle industrielle.

LA CULTURE de MERISTEMES ou l'élimination de virus

  • Définition

Les méristèmes sont des zones de cellules à divisions intenses, situés au cœur des bourgeons et des extrémités de racines et à l'origine des tiges feuillées ou du système racinaire.

En 1950, les travaux de Limasset et Cornuet  ont montré que les méristèmes étaient indemnes de virus.

  • Technique

La culture de méristème est une culture aseptique sur milieu artificiel du dôme apical sans ébauche foliaire. Il mesure 0,2 à 0,3 mm de côté et la dissection se fait sous loupe binoculaire. La technique peut être associée à de la thermothérapie: culture à température élevée, pour favoriser l'élimination des virus.

  • Objectif

C'est la seule façon d'obtenir des plantes saines indemnes de virus.

  • Avantages

La culture de méristèmes permet le sauvetage des variétés menacées de disparition car très virosées. Elle concerne essentiellement les plantes à reproduction par voie végétative: bouturage, marcottage, etc. tels le Pelargonium, le dahlia, le chrysanthème, la pomme de terre, l'artichaut, le fraisier, framboisier, etc. car cette voie favorise la transmission des virus à la descendance.

Les plantes produites sont saines: sans virus, champignons et bactéries et répondent aux normes phytosanitaires d'échanges internationaux de plus en plus draconiennes.

Les plantes assainies ont une vigueur accrue, et des qualités de floraison et de fructification restaurées.

On obtient des variétés conformes à la variété d'origine et que l'on peut multiplier en grande quantité, la production est homogène.

  • Limites

Les plantes obtenues sont indemnes de virus mais ne sont pas devenues résistantes aux virus. Elles peuvent être recontaminées via des insectes si des mesures de prophylaxie ne sont pas prises.

Pour certaines variétés qui présentent des chimères:plantes panachées de Petunia ou de Pelargonium par exemple, par culture de méristèmes il est possible de ne pas retrouver à la régénération ce caractère horticole.

  • Applications

De nombreuses variétés de diverses espèces ont été sauvegardées grâce à cette technique: pomme de terre (Belle de Fontenay en 1954), dahlias, fraisiers, vigne, iris, framboisiers etc.

La Violette de Toulouse a été sauvée du déclin grâce à la culture de méristèmes qui a permis de régénérer des plantes sans virus.

Beaucoup de plantes horticoles de grande diffusion tels le Pelargonium, le chrysanthème etc. sont produites à partir de pieds mères qui ont été assainis par culture de méristèmes. Il en est de même pour des espèces maraîchères tel l'artichaut ou encore le fraisier.

L'EMBRYOGENESE SOMATIQUE
  • Définition

L'embryogenèse somatique est une forme de multiplication végétative qui permet d'obtenir une multitude de plantules identiques génétiquement à la plante donneuse d'explants.

C'est l'obtention d'embryons à partir de cellules somatiques, c'est à dire non sexuelles.

  • Technique

De nombreuses divisions cellulaires sont rapidement provoquées à partir des tissus cultivés grâce à l'apport d'une forte dose d'auxine. Un cal est alors obtenu, c'est à dire un amas de cellules indifférenciées, rejuvénilisées et qui pourront donner naissance à des embryons bipolaires qui vont se comporter comme des embryons zygotiques, (issus de la fécondation entre une cellule sexuelle femelle et une cellule sexuelle mâle).

  • Applications

L'embryogenèse somatique est une technique qui s'adapte bien à la production industrielle. Les embryons somatiques peuvent être initiés dans des bioréacteurs, afin soit de produire des semences artificielles en les encapsulant dans un gel nutritif, ou encore pour la synthèse de métabolites secondaires utilisés dans des médicaments, colorants, etc. Ce peut-être également un moyen de cloner des ligneux.

Embryon somatique de caféier

Un litre de milieu de culture contenu dans un fermenteur peut produire des milliers, voire des millions d'embryons somatiques.

C'est une technique qui s'applique bien au fenouil, au caféier, au citronnier, à la luzerne, à la carotte, au pétunia, à l'aubergine, au cacaoyer, à l'hévéa, au palmier à huile, etc.

  • Avantages

Cette technique de multiplication s'adapte à l'automatisation, ce qui permet de réduire les coûts de production.

Le rendement en plantes produites est très élevé.

Les embryons obtenus sont d'origine unicellulaire, il n'y a donc pas de problème de  chimères

L'embryogenèse somatique permet la rejuvénation des tissus ainsi qu'un accès aux transformations génétiques.

C'est un bon moyen pour produire des clones d'individus élites chez les ligneux.

  • Limites

Le passage par cal peut amener des risques de dérive génétique, c'est à dire d'obtention de variants qui seraient différents de la plante de départ.

L'HAPLO-DIPLOÏDISATION ou la création de lignées pures 

Les plantes haploïdes sont issues d'une cellule sexuelle mâle ou d'une cellule sexuelle femelle sans fécondation. Les plantes obtenues n'ont qu'un seul lot de chromosomes au lieu de 2 normalement, qui est doublé naturellement ou artificiellement afin qu'elles deviennent fertiles.

Elles peuvent être obtenues par androgenèse, par gynogenèse, par fécondation avec du pollen irradié ou par croisements interspécifiques.

Il existe dans la nature à des pourcentages très faibles des plantes haploïdes, non issues de fécondation normale.

L' ANDROGENESE ou les plantes "sans mère"

  • Technique

C'est la régénération de plantes entières à partir de culture de cellules sexuelles mâles: des grains de pollen immatures, soit par culture de pollen isolé, soit par culture d'anthères.

  • Objectif

Obtenir des plantes haploïdes doublées, (après doublement spontané ou artificiel par colchicine). Ainsi des lignées pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 à 10 ans par technique classique d'autofécondations.

L'obtention de lignées pures est une étape presque toujours nécessaire des programmes d'amélioration des plantes.

  • Illustration : Androgenèse du blé tendre

       

Culture des anthères, puis au bout de 1 à 2 mois les embryons androgénétiques sortent des anthères

   

Les embryons sont repiqués et forment des plantules, certaines sont albinos

 

Les plantules sont acclimatées après doublement artificiel du nombre de chromosomes avec de la colchicine. Puis les plantes haploïdes doublées sont cultivées en plein champ
  • Applications

C'est une technique utilisée chez le blé, le riz, la pomme de terre, le tabac, le maïs, l'asperge, le piment, etc. et en routine chez le colza, l'orge et l'aubergine.

Le blé Florin a été la première variété issue d'androgenèse inscrite au catalogue français. Ce fut une première mondiale initiée par le laboratoire d'Amélioration des Plantes d'Orsay. Aujourd'hui de nombreux cultivars de diverses espèces et issus de ces techniques d'haplo-diploïdisation sont déposés chaque année.

  • Avantages

Cette technique amène un important gain de temps, ce qui permet de mettre plus rapidement sur le marché de nouvelles variétés présentant des avantages pour l'agriculteur, l'industriel ou le consommateur. En effet une plante homozygote  est directement obtenue, ce qui évite de faire une dizaine de générations d'autofécondations pour obtenir une lignée pure, état nécessaire aux programmes de sélection végétale.

Les plantes obtenues par cette technique sont totalement homozygotes, cela permet de dévoiler des caractères intéressants par l'expression des allèles récessifs  habituellement cachés. Ces gènes pouvant être exploités éventuellement.

Des recombinants intéressants peuvent ainsi être détectés et exploités, une résistance à une maladie par exemple.

  • Limites

Le rendement, (nombre de plantes viables/100 anthères cultivées) est souvent dépendant du cultivar.

Certaines variétés de céréales produisent un grand nombre de plantes albinos, donc non viables.

          

La GYNOGENESE ou les plantes "sans père"

  • Technique

On cultive des ovules ou des ovaires non fécondés, le plus souvent immatures, sur un milieu artificiel. On obtient des plantules ayant un seul stock de chromosomes.

 

Embryon émergeant d'un ovule de betterave non fécondé

  •  Objectif

L'objectif est le même que pour l'androgenèse. Mais la gynogenèse est souvent utilisée chez les espèces qui sont récalcitrantes à l'androgenèse

  • Avantages

Par rapport à l'androgenèse, les risques d'obtention de plantes albinos sont fortement diminués voire nuls.

  • Applications
C'est une technique utilisée chez la betterave sucrière, le gerbéra, le riz, la laitue, la pastèque, le pommier, le triticale, le tournesol, etc.

Les autres techniques de gynogenèse:

  • Les croisements interspécifiques

En fécondant un ovule avec du pollen d'une autre espèce, souvent sauvage et proche, il y a développement d'un embryon mais élimination des chromosomes de l'espèce sauvage. La plantule qui se développe est haploïde.

C'est une technique largement utilisée chez l'orge, (Hordeum vulgare X Hordeum bulbosum), mais également chez le blé et la pomme de terre (Solanum tuberosum X Solanum phureja).

  • Pollinisation avec du pollen irradié

Irradier du pollen le rend inactif mais néanmoins capable d'initier des divisions cellulaires de l'ovule. Ceci permet l'obtention d'une plantule sans fécondation donc également avec le seul lot de chromosomes maternels.

Les fruits qui se développent, par parthénogenèse , n'ont pas de graines ou de pépins. Ce qui est intéressant pour le melon ou la pastèque par exemple.

Cette technique est utilisée chez le melon, le pétunia, l'asperge, l'oignon, la pastèque.

 CREATION de VARIABILITE

Les mutations  conduisent à la création d'un nombre croissant de nouvelles variétés: plus de 2 000 variétés ont été créées à partir de mutations naturelles ou induites.

Beaucoup de mutations apparaissent naturellement, si certaines sont létales, d'autres peuvent être mises à profit par l'obtenteur ou le producteur et de nouveaux types apparaissent:nectarine, cerisier auto-fertile, chou-fleur, betterave monogerme (évitant le démariage), colza sans acide érucique (huile ainsi non toxique), fruit de pamplemousse sans pépin ou à pulpe rose, etc.

En amélioration des espèces florales, fruitières ou maraîchères notamment, on peut avoir  recours à la mutation induite par le biais de diverses techniques pour en augmenter la fréquence:

  • Techniques
 Les radiations ionisantes

C'est la source principale de création de mutants. Ces mutants ne donnent pas toujours directement de nouvelles variétés, mais les plantes obtenues peuvent être des géniteurs qui entrent dans un programme de croisements.

 La mutagenèse chimique

Des produits mutagènes inclus dans les milieux de culture peuvent induire des mutations intéressantes au niveau horticole ou agronomique.

La variation somaclonale ou les vitrovariants

Le passage par cal  ou le nombre de cycles de culture in vitro sont des facteurs qui peuvent induire des variants, c'est à dire des plantes dont le génome est sensiblement différent de celui de la plante de départ. Il est possible de créer de la variabilité via les cultures cellulaires également, cette voie est explorée chez l'asperge par exemple. Pour cela on introduit des pressions de sélection tels le froid, des toxines, de la salinité et au moment de la régénération on peut obtenir des plantes nouvelles qui peuvent être résistantes au sel, à la sécheresse, à des maladies, etc., et que l'on n'aurait pas pu obtenir par une autre façon. Ces variants peuvent entrer dans des programmes de sélection, le Pelargonium "Velvet Rose" a été obtenu ainsi.

  • Applications

Des mutants ont été créés par exemple chez les céréales. On a pu créer par mutagenèse un colza avec une meilleure résistance à l'alternaria, (une maladie fongique).

Pour de nombreuses espèces cultivées: tabac, tomate, céleri, canne à sucre, fenouil, laitue, etc. des variations somaclonales ont amené de nouveaux caractères intéressants: résistance aux maladies, précocité de floraison, couleur et forme des fleurs, accroissement de vigueur.

Les mutations naturelles peuvent également être exploitées pour créer de nouvelles variétés.

  • Limites

    Les modifications apparaissent aléatoirement sur les chromosomes et la proportion de mutants présentant un intérêt horticole ou agronomique est faible.

         

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